福岡県農業総合試験場研究報告14（1995） pp 163 - 166
カンキツタターリーフウイルス検出のためのＥＬｌＳＡの改良
草野成夫・下村克己
カンキツタターリーフウイルス（ＣＴＬＶ）のＥＬＩＳＡによる検定について，サンプル磨砕から発色操作に至るまでの検出に最適な条件を検討した。サンプルを磨砕する際の緩衝液は，０．１％チオグリコール酸加用０．１Ｍクエン酸緩衝液（ＣＢ−Ｔ）が良く，０．１５Ｍ Ｎａｃｌ加用０．１Ｍ・ｐＨ７．２リン酸緩衝液（ＰＢＳ）と比較して検出感度が３倍以上に向上した。検査するサンプルは，発芽後から３０日程度経過の新梢では検出が可能であるが，５０日以上の硬化葉及び旧葉では検出が困難であった。凍結サンプルからの酵素抽出は，希釈率２５０倍まで検出可能であった。また，サンプル磨砕液と酵素結合抗体液を同時に分注することにより，従来法に比ベ，大量の検体を検査するときに利用する凍結サンプルや凍結磨砕液での検出感度が向上した。同時分注後の静置温度及び時間は，３７℃では極端に検出感度が低下したが，４℃で４時間以上行うことで，希釈率が８１０〜２，４３０倍まで判定が可能となった。なお，市販抗体をビオチン標識抗体に作り替えることで検出感度が向上し，発芽後５０日以降の検定が可能となった。
［キーワード：カンキツタターリーフウイルス，ＥＬＩＳＡ，分注法，静置温度］
Improvement of Enzyme-Linked Immunosorvent Assay (ELISA) for Detection of Citrus Tatter Leaf Virus. KUSANO Nario and Katsumi SHIMOMURA (Fukuoka Agric. Res. Cent. , Chikushino, Fukuoka 818, Japan) Bull. Fukuoka Agic. Res. Cent. 14 : 163-166 (1995)
Several conditions were examined for the detection of citrus tatter leaf virus (CTLV). The best buffer for homogenization of leaves was 0.1M citric acid containing 0.1% thioglycolic acid (CB-T) and the dilution end point using CB-T was 3 times higher compared to 0.1M phosphate buffered saline (PBS). In CTLV, young leaves of 30 days after sprouting were detectable, but old leaves more than 50 days after sprouting were not detectable. Dilution tests for CTLV using enzyme extract from frozen leaves proved that the detectable dilution end point was 250 times higher. The sensitivity of detection was higher with pouring sample extract and enzyme conjugated antibody solution. The best result was obtained with incubation period for more than 4 hours at 4 ℃. This operation made the detectable dilution end point higher and the dilution end point was 810 - 2,430 times. The virus detection on the leaves of 50 - 70 days after sprouting was possible by modifying commercialy available antibodies specially biotinylated conjugate.
[Key words : Citrus tatter leaf virus, ELISA, Pouring method, Incubation temperature]
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