福岡農総試研報15（1996）
低塩漬け物の微生物制御条件を明らかにするため，浸透圧と有機酸の種類が微生物の生育に及ぼす影響を検討した。低塩漬け物の調味料としてグルコース，エタノールを使用する場合，各成分の浸透圧の合計値を保存性の指標として用いることができた。リンゴ酸，クエン酸，酒石酸，乳酸を用いて漬け液のｐＨを調整する場合，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ-ｉａ ｃｏｌｉの生育抑制効果に差は認められなかった。酢酸は抗菌効果が高く，０．１％の添加でＥ．ｃｏｌｉの増殖による濁度の増加を防止した。
［キーワード：低塩漬け物，微生物制御，浸透圧，有機酸，酢酸］
Studies on the Microorganism Control Technique for Low-Salt Pickles.
U. Influence of osmotic pressure of solution and organic acids. BABA Noriko,
Sumitaka YAMASHITA, Naoko FUKAHORI (Fukuoka Agricultural Research Center,
Chikushino, Fukuoka 818, Japan) Bull. Fukuoka Agric. Res. Cent. 15:61 -
63(1996) To prevent low-salt pickles from going bad, the influence
of osmotic pressure and the addition of organic acids on antimicrobial
activities were investigated. When using glucose and ethanol as a seasoning
for pickles, it was possible to use the total value of the osmotic pressure
of each ingredient as the quality maintenance index for manufacturing and
preserving low-salt pickles. When adjusting the pH of the pickling liquid,
using a malic acid, citric acid, tartaric acid and lactic acid, there was
no difference in the growth of the inhibitory effect of Escherichia
coli. The antimicrobial activity of acetic acid was higher than those
of other acids. Also, with the addition of 0.1% of the acetic acid prevented
the culture medium was saved from turbidity caused by the propagation of
E.coli.
[Key words: acetic acid, antimicrobial, low-salt pickles, organic acid,
osmotic pressure]
緒 言
最近の消費者の漬け物に対する指向は，低塩化に進みながら，調味漬けや酸味漬けも好まれる傾向がある。
第１報１）では低塩漬け物の基本的な品質保持条件として塩分・ｐＨ・温度を用いた簡易な評価方法を検討した。
このうち塩濃度による保存性の向上は塩の浸透圧によるものてあり，微生物の生育に適さない浸透圧の条件下では，微生物は脱水され，繁殖できず，腐敗が防止される。 そこで，本報では，低塩漬け物の品質評価を行うために，調味料として塩，グルコース及びエタノールを用いた場合の浸透圧の算出と，総浸透圧が微生物の生育に及ぼす影響を明らかにした。また，酸味料としてｐＨ調整に使用する有機酸の種類が品質保持に及ぼす影響について検討した。
試 験 方 法
１ 微生物の生育柳制試験
（１）供試菌株：グラム陽性菌としてＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＦＯ ３０２３，Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ＩＦＯ ３４２６，グラム陰性菌としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉi ＩＦＯ ３３０１， Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＩＦＯ ３０８１，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ ＩＦＯ １２０１０，酵母としてＨａｎｓｅｎｕｌａ ａｎｏｍａｌａ ＩＦＯ ０１４４、Ｃａｎｄｉｄａ ｓａｋｅ ＩＦＯ ０４３５の計７菌株を供試した。
（２）培養条件：増殖用培地１）に３〜８％濃度の塩化ナトリウムまたは０〜３５％のグルコースを加え，１５ｍＩを試験管に分注した。オートクレーブで殺菌した後，前培養した菌 懸濁液０．１ｍｌを加え，各温度条件で７日間培養を行った。エタノールを加える場合は，０．４５μｍのミリポアフィルターでロ過滅菌し，オートクレーブ後の培地に加えた。
（３）ｐＨ調整方法：０．１規定塩酸または各種有機酸を用いた。有機酸を添加する場合は，０．４５μｍのミリポアフィルターでロ過滅菌後，オートクレーブ後の増地に加えた。
（４）濁度測定方法：培地を撹絆し，６６０ｎｍの吸光度をＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒＡＮＡ−７Ａ（東京光電）で測定した。
濁度（△Ｏ．Ｄ．）＝Ｃ（１）−Ｃ（０）
Ｃ（１）：培養後Ｏ．Ｄ．， Ｃ（０）：培養開始時Ｏ．Ｄ．
（５）生菌数測定条件：滅菌リン酸緩衝希釈水で適宣希釈した菌懸濁液をデスオキシコレート培地に加え，３７℃で２日培養し，生じたコロニー数を計測した。
（６）浸透圧算出式：
結果及び考察
１ 浸透圧調整による微生物制御方法
浸透圧の算出式はＶａｎ’ｔ‐Ｈｏｆｆの式（T式）が一般に用いられているが，Ｖａｎ’ｔ‐Ｈｏｆｆの式は希薄溶液のものであって，高濃度溶液には適用できない。
Ｐ＝ｎＲＴ …Ｉ式
ｎ＝モル濃度， Ｒ＝気体定数， Ｔ＝絶対温度
特に食塩の場合には濃度により電離度が異なるため，濃度と電離度を考慮に入れて浸透圧を検討する必要がある。そこで小川ら６）はＶａｎ’ｔ‐Ｈｏｆｆの改良式としてT〜Vの式を提唱している。
さらに，小川ら２）は，酵母Ｃａｎｄｉｄａ ｓａｋｅを用い，培養温度３０℃でその増殖と浸透圧の関係を検討し，福神漬けにおいて食塩，砂糖等の総浸透圧が１２２気圧以上であれば酵母等の増殖による袋の膨張を防止できるとしている。
しかし，第１報で示すように，低塩漬け物の場合は貯蔵中の細菌類の増殖阻止が重要であり，小川ら６）の結果をそのまま適用することは困難であると考えた。そこで，浸透圧の算出には電離度を考慮した小川らの式（U〜W式）を用い，総浸透圧約５８気圧の条件下でのグルコース及びエタノールの微生物制御作用の評価方法をＥ．ｃｏｌｉを用いて検討した。
第１表に塩の代替物質としてグルコースを用いた場合の，Ｅ．ｃｏｌｉの生育に及ぼす影響を示した。試験区は表中に示したように段階的に塩分を低下させ，その差し引き浸透王をグルコースで補うよう設定した。このように異なる濃度配分でＥ．ｃｏｌｉを培養した結果，全ての区で濁りが防止でき，１０℃及び１５℃では生菌数もほぼ同じ値を示した。
エタノールについてもU式及びW式を用いて同様な試験を行い，濁りの防止及び生菌数において各試験区で大きな差がないことを認めた（第２表）。
このことは，グルコース及びエタノールを塩の代替物質として用いることができ，さらにU〜W式を用いて算出した各成分の浸透圧合計値を品質保持期限の推定に用いることができると考えられる。つまり，第１報で示した品質保持指標の塩分濃度を浸透圧に換算し，目標浸透圧値とすることにより，食塩，糖，アルコールの調味成分を自由に設定できることが考えられる。
２ 各種有機酸の微生物制御効果
リンゴ酸，クエン酸，酒石酸，乳酸，酢酸を用いた場合の添加濃度とｐＨ低下作用との関係を第１図に示した。同濃度添加した場合，解離定数が小さい酢酸は他の有機酸に比較してｐＨの低下が小さいことが明らかになった。
次に，各種有機酸を用いてｐＨ３．５またはｐＨ４．０に調整した培地でＥ．ｃｏｌｉを培養し，７日間経過後の生菌数を第３表に示した。各区とも濁度の増加は認められなかったが，酢酸を用いた場合は生菌数としても全く検出されず，同一ｐＨにおいて他の有機酸よりも静菌作用が非常に強いことが示された。また，酢酸以外の有機酸では静菌性にほとんど差は認められなかった。
ＢＲＯＷＮら２）は，酸の性質を強酸と弱酸に分け，前者は解離定数が大きく，生じる高濃度のＨ+によって微生物の生育を阻害し，後者は解離定数が小さく，非解離分子の割合が高いために微生物の細胞膜の透過性が高く，細胞に傷害を与えることで静菌性を示すとしている。ＤＯＯＲＥＳ４）も，一定のｐＨ域において酸の種類により静菌性が異なる理由として，各酸の解離定数の違いにもとずく非解離分子の割合
Ｐ＝ｎＲＴ…Ｉ式
ｎ＝モル濃度， Ｒ＝気体定数， Ｔ＝絶対温度
が異なることをあげている。
供試した各種有機酸の解離定数を第４表に示す。解離定数（Ｋａ）の高いリンゴ酸（Ｋ１＝１０-3.46，Ｋ２＝１０-5.05），クエン酸（Ｋ１＝１０-3.13，Ｋ２＝１０-4.76，Ｋ３＝１０-6.40），酒石酸（Ｋ１＝１０３-3.04，Ｋ２＝１０-4.36）及び乳酸（Ｋ１＝１０-3.86）の抗菌性は解離したＨ＋に起因し，解離定数が低い酢酸（Ｋ１＝１０-4.76）は非解離分子そのものの静菌性によるものと推測された。
また，Ｃｈｉｎｇｊｕら３）は，脂肪酸は細胞壁に対する親和性が高く，その静菌作用はアミノ酸の取り込み阻害，蛋白質漏出作用，呼吸阻害などに起因していることを報告している，弱酸で短鎖脂肪酸の一種である酢酸の強い抗菌作用も同様のメカニズムであると推測できる。
酢酸の各種菌株に対する生育抑制効果を検討し，その結果を第５表に示した。Ｃ．ｓａｋｅ及びＨ．ａｎｏｍａｌａは塩濃度やｐＨ調整だけではその生育を抑えることは困難であることを第１報で述べたが，酢酸を添加した場合はＨ．ａｎｏｍａｌａで０．５％，Ｃ．ｓａｋｅでは０．３％の添加で濁りを抑えることができた。また，Ｅ．ｃｏｌｉに対する生育抑制効果を第６表に示した。酢酸は０．１％（ｐＨ４．５２）の添加でＥ．ｃｏｌｉの濁度増加を防止し，０．４％（ｐＨ４．０２）添加で生菌として検出されなくなり,わずかな添加量でも静菌効果が得られることが明らかになった。
以上のように，第１報で報告した塩分，ｐＨ，温度による品質保持指標に加え，糖及びアルコールを調味料に用いた場合の微生物制御効果を浸透圧の観点から検討し，算出した浸透圧値を品質保持の推定に適用できることを明らかにし，さらに，酸味料として酢酸を用いる場合の指標を作成した。これらの結果は低塩漬け物だけでなく，加工食品全般における微生物制御のための基礎資料として幅広く応用できる。
引 用 文 献
１）馬場紀子・山下純隆・深堀奈保子（１９９６）低塩漬け物の品質保持技術（第１報）塩・ｐＨ・低温が保存性に及ぼす影響．福岡農総試研報１５：〜．
２）ＢＲＯＷＮ，Ｍ．Ｈ．ａｎｄ ＢＯＯＴＨ，Ｉ．Ｒ．（１９９１）：Ｆｏｏｄ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓ ３．Ａｃｉｄｕｌａｎｔ ａｎｄ ｌｏｗ ｐＨ，ＡＶｉＶａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄ Ｒｅｉｎｈｏｌｄ Ｎ．Ｙ．：２２〜４３．
３）Ｃｈｉｎｇｊｕ，Ｗ.ｅｔ．ａｌ（１９７２）：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１１：５１６
４）ＤＯＯＲＥＳ，Ｓ．（１９９３）：Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ，Ｓｅｃｏｎｄｅｄｉｔｉｏｎ ４．Ｏｒｇａｎｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．：９５〜１３６．
５）日本化学会編（１９６６）化学便覧（基礎編U）．丸善：１０５３〜１０５８．
６）小川敏男・青木睦夫・本庄達之助（１９７４）浸透圧による漬物の変敗防止に関する研究．東京農試研報８：１〜２４．